(Neurological Institute Head of the Department prof. John Hardy)

Periodo svolto: 1 Aprile 2015 – 30 ottobre 2015
La prima parte della mia esperienza professionale a Londra si è svolta presso il Neurological Department dell’UCL in cui ho preso parte ad un progetto sulla Paraplegia Spastica ereditaria, la seconda patologia neurodegenerativa più frequente subito dopo la SLA. Grazie a questa collaborazione ho potuto utilizzare le più moderne tecniche di Next Generation Sequencing al fine di applicarle agli altri tipi di patologie, in particolare le oncoemetologiche. A tale proposito, in concomitanza a ciò ho avuto la possibilità di integrare la mia esperienza professionale frequentando il Citogenetic Laboratory, Department of Haemathology, Royal Free NHS Foundation Trust, London, UK (http://www.ucl.ac.uk/leukemia-cytogenetics). Director: dr Elisabeth Nacheva
Relazione
Il Laboratorio di Citogenetica dell’Ospedale Royal Free riceve circa 1300 casi all’anno di pazienti affetti da malattie oncoematologiche. Vengono eseguite analisi, mediante citogenetica classica e molecolare, al fine di indagare le alterazioni cromosomiche presenti, importanti per confermare una diagnosi già condotta in prima istanza, la prognosi e un’eventuale terapia mirata.
Le malattie onco-ematologiche maggiormente trattate sono state:
- AML (leucemia mieloide acuta)
- MPD (malattie mieloproliferative: leucemia mieloide cronica, policitemia vera e trombocitemia essenziale)
- NHL (linfomi Non-Hodgkin)
- MM (mieloma multiplo)
- MDS (sindromi mielodisplastiche)
Ho avuto la possibilità di eseguire, in prima persona, tutte le metodiche di citogenetica classica e molecolare, applicabili nell’ambito dell’oncoematologia, utilizzare le più moderne attrezzature disponibili in questo campo e confrontarmi e discutere insieme, al personale altamente qualificato del reparto, i risultati in merito alle analisi da me eseguite, al fine della stesura di un referto oncoematologico.
Più nel dettaglio la mia attività in laboratorio è stata svolta nel seguente modo:
- Raccolta dei campioni (sangue periferico, midollo osseo e biopsie) di pazienti affetti da malattie oncoematologiche; accettazione e registrazione dei casi.

- Scelta della metodica da utilizzare a seconda del tipo di patologia (particolare attenzione è svolta nel caso del mieloma multiplo, in cui il primo passaggio consiste nella separazione delle plasmacellule da sangue periferico o sangue midollare).

- Analisi dei riarrangiamenti cromosomici (anomalie di numero e di struttura) mediante citogenetica classica, secondo il seguente protocollo:

colture di sangue midollare e allestimento di preparati cromosomici: il sangue midollare o periferico prelevato, viene posto in provetta eparinata di cui 20 ml utilizzati per la conta dei globuli in camera conta globuli. Si passa successivamente alla messa in coltura per 24h, e alla sincronizzazione per 48/72h. Le colture cosi allestite, sono incubate a 37°C in incubatore a CO2. Un’ora prima del termine delle colture si aggiunge il colcemid (soluzione che stoppa le cellule allo stadio di metafase) e si procede al processamento seguendo un protocollo standard comune in tutti i laboratori di citogenetica. Alla fine il pellet ottenuto, che rappresenta la frazione nucleare della coltura, viene sospeso in un volume variabile di fissativo fresco e utilizzato per l’allestimento dei vetrini.

Allestimento dei vetrini da colture di sangue midollare o periferico

Colorazione in bande G e analisi citogenetica: per l’analisi di routine, i vetrini vengono colorati in soluzione Giemsa. Segue l’analisi al microscopio ottico.

- Analisi dei riarrangiamenti cromosomici mediante citogenetica molecolare: la citogenetica tradizionale, seppur utilissima, è necessariamente limitata nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione del microscopio, non è in grado ad esempio di individuare alterazioni cromosomiche quali delezioni criptiche, traslocazioni, marcatori, comuni a molte malattie onco-ematologiche, per cui si procede utilizzando tecniche di citogenetica molecolare, quali l’ibridazione in situ fluorescente (FISH) e l’array-CGH.

Fluorescence in situ hybridization (FISH): questa metodica si basa sulla proprietà del DNA di denaturarsi in modo reversibile (apertura della doppia elica) e prevede il legame fra un frammento di DNA specifico per la regione di interesse, marcato con composti fluorescenti (sonda), e la sequenza complementare al DNA in esame. Tale regione viene cosi visualizzata al microscopio a fluorescenza. L’applicazione della FISH in campo oncologico è molto importante poiché può fornire informazioni sulla terapia più adeguata in un determinato paziente (Targeted Therapy).

L’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array - Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH): con tale metodica si è grado di valutare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche a livello dell’intero genoma in un unico esperimento, senza sapere in anticipo cosa cercare. Ho utilizzato questa tecnica in particolare nei casi di Mieloma Multiplo, caratterizzato da delezioni criptiche che coinvolgono diversi cromosomi quali l’1, 3, 5, 6, 9, 11,13,15. Anche questa metodica è importante ai fini della terapia mirata e della prognosi, ad esempio la delezione a carico del braccio lungo del cromosoma 1 è associata a prognosi infausta nel mieloma multiplo.


Nell’ultimo mese mi sono occupata dell’applicazione delle più moderne tecniche di Next Generation Sequencing, utilizzando il TruSight Myeloid Sequencing Panel (piattaforma Illumina MiSeq). I campioni (massimo 96) vengono caricati sul MiSeq e i dati informatici analizzati mediante Variant Studio software. Questo pannello è in grado di analizzare 54 geni (15 full genes e 39 additional genes), frequentemente mutati in:
Leucemia Mieloide acuta
Sindromi mielodisplastiche
Sindromi mieloproliferative
Leucemia Mieloide Cronica
Leucemia mielomonocitica cronica
Leucemia mielomonocitica giovanile
Conclusioni:
Diagnosticare una neoplasia ematologica è un processo complesso, in quanto esistono diverse metodiche che devono essere integrate e armonizzate. Occorre seguire una sequenza razionale per ottimizzare tempi e risorse e per classificare la patologia secondo le più recenti linee guida internazionali. Inoltre, dovendo reperire precise informazioni biologiche ai fini della prognosi, le indagini diagnostiche risultano ulteriormente articolate.
L’aver trascorso questi mesi in un centro altamente specializzato nella diagnosi genetica delle malattie del sangue, mi ha permesso di venire a conoscenza delle moderne tecniche di sequenziamento (Next Generation Sequencing) che ormai stanno prendendo piede sempre di più anche nel nostro paese. Grazie a questa metodica è possibile sequenziare contemporaneamente un elevato numero di target genetici, con il notevole vantaggio di ridurre i costi. Questa innovazione tecnologica consente infatti di costruire una “mappa” dei geni alterati, conosciuti e non, per poterne capire i meccanismi d’azione, perfezionare la diagnosi di malattia e, in alcuni casi, suggerire l’approccio terapeutico più appropriato sulla base della presenza o assenza di specifiche mutazioni. Lo scopo è proprio quello di mettere a punto questa metodica presso il Policlinico e di condurre un’analisi mirata al fine della ricerca e quindi della diagnostica nel campo dell’onco-ematologia.

www.beat-leukemia.org

Seguici su

Sostieni Beat-Leukemia

Fai la donazione

Puoi scriverci ora

info@beat-leukemia.org

Fondazione Beat Leukemia Dr Alessandro Cevenini - CF 94618790151 | Legal Notices | Realizzazione sito web: Progetto Web