La leucemia linfoblastica acuta pediatrica di tipo B (B-LLA) è il tumore più comune nei pazienti di età pediatrica con un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 90%. Nonostante una percentuale così elevata di successi, i pazienti refrattari alla malattia o coloro che vanno incontro ad una ricaduta dopo una prima fase di remissione, rappresentano ad oggi la vera sfida nel campo della ricerca, in quanto sono coloro i quali presentano la prognosi più severa. È stato ipotizzato che il fallimento del trattamento possa anche essere legato al ruolo di protezione svolto dal microambiente midollare, corrotto dai blasti leucemici. Pertanto, nuove strategie terapeutiche mirate all'interazione leucemia/stroma potrebbero essere determinanti in questo contesto.
Il nostro gruppo ha identificato Attivina di tipo A come un nuovo potenziale bersaglio terapeutico in quanto è emerso come questa molecola svolga un ruolo pro-leucemico all’interno della nicchia midollare. In particolare, la Dott.ssa Di Marzo sta seguendo due filoni di ricerca focalizzati su questa molecola: i) lo studio di Attivina di tipo A nella resistenza alla chemioterapia delle cellule leucemiche di B-LLA trattate con i farmaci comunemente usati negli attuali protocolli di trattamento; ii) la comprensione dei meccanismi alla base della maggior metastatizzazione al Sistema Nervoso Centrale (CNS) delle cellule leucemiche attivate con Attivina di tipo A.
Per quanto riguarda il primo filone di ricerca, la Dott.ssa Di Marzo ha eseguito saggi di vitalità cellulare in citofluorimetria sulla linea leucemica pre-incubata o meno con Attivina di tipo A e trattata con i farmaci Asparginasi, Desametasone e Vincristina. Inoltre, ulteriori valutazioni della vitalità cellulare sono state eseguite in una fase successiva dello studio, aggiungendo una molecola ad azione inibitoria verso il recettore che lega Attivina di tipo A, quale il SB431542. I saggi eseguiti hanno evidenziato come il trattamento con Attivina di tipo A sia in grado di fornire una protezione contro i farmaci chemioterapici, mentre l’inibitore è risultato efficiente nel bloccare il vantaggio conferito da questa molecola alle cellule leucemiche. Tali risultati suggeriscono come Attivina di tipo A possa essere una molecola chiave nel meccanismo di chemio-protezione e che la sua azione può essere bloccata con molecole specifiche. Questi dati aprono la strada per una nuova modalità per contrastare la leucemia: oltre ai normali farmaci chemioterapici si potranno utilizzare farmaci che, eliminando ad esempio Attivina di tipo A, rendono meno “ospitale” il microambiente midollare alla leucemia.
Per quanto riguarda il secondo filone di ricerca, la Dott.ssa Di Marzo ha approfondito i dai a pubblicati dal nostro gruppo sulla rivista Haematologica nel 2018, che mostrano come in modelli murini le cellule leucemiche pre-attivate con Attivina di tipo A, oltre a causare una più rapida evoluzione della malattia, sono in grado di dare maggiore metastatizzazione al CNS. Per tale motivo la Dott.ssa Di Marzo, sta studiando come Attivina di tipo A possa “aiutare” la cellula leucemia ad entrare nel cervello e a “corrompere” l’ambiente circostante rendendolo favorevole alla sua crescita. A tal fine la Dott.ssa Di Marzo ha messo a punto un modello in vitro di fettine organotipiche corticali cerebrali murine (Fig.1) in cui è possibile iniettare le cellule leucemiche direttamente nel tessuto cerebrale e quindi studiare le interazioni tra leucemia e microambiente cerebrale.
Il primo obiettivo di questo studio è stato quello di definire se le cellule leucemiche pre-trattate
con Attivina di tipo A, fossero in grado di sopravvivere nel tessuto cerebrale una volta iniettate
nella fettina organotipica. Le cellule leucemiche sono state colorate con 4',6-diamidin-2-
fenilindolo (DAPI) un colorante vitale che colora le cellule in blu, al fine che possano essere
osservate tramite microscopia a fluorescenza. Come si può osservare in Fig 2, Pannello A, le
cellule leucemiche colorate con DAPI (in blu) sono presenti dopo 7 giorni dall’iniezione.
Analizzando più nel dettaglio la vitalità di queste cellule mediante analisi citofluorimetrica
(Pannello B), si può osservare come la maggior parte di queste siano vitali.
. Inoltre la Dott.ssa Di Marzo ha valutato se la presenza della leucemica attivata con Attivina di tipo A potesse generare “sofferenza” nel tessuto cerebrale ( Fig. 3). A tal fine, è stato condotto un saggio in cui è stata valutata tramite fluorescenza la sofferenza delle cellule cerebrali, dopo la microiniezione di cellule leucemiche, utilizzando una molecola (ioduro di Propidio) di colore rosso, che viene incorporata solo dalle cellule che stanno per morire. I risultati ottenuti al microscopio a fluorescenza hanno evidenziato che le cellule leucemiche pre-trattate con Attivina di tipo A hanno indotto nel tessuto cerebrale una maggior mortalità dopo 24 ore, 3 e 7 giorni dalla microiniezione rispetto alle cellule leucemiche non pre-trattate con Attivina (Pannello A). Questo è meglio osservabile dal grafico rappresentato nel Pannello B. Il pannello A mostra le immagini in cui è stata rilevata la mortalità (in rosso) del tessuto cerebrale indotta dalle cellule leucemiche (NALM-6) pre-trattate o non con Attivina di tipo A. Il pannello B mostra i risultati della quantifica della mortalità del tessuto cerebrale indotta dalle cellule leucemiche. Legenda: CTRL=fettine controllo, NALM-6 NS= fettine con cellule non pre-trattate, NALM-6 ActA= fettine con cellule pre-trattate).
Questi risultati suggeriscono che le cellule leucemiche pre-trattate sono in grado di indurre nel tessuto cerebrale più sofferenza rispetto a quelle non pre-trattate con Attivina di tipo A.
Inoltre, sono state effettuate analisi di espressione genica nel tessuto cerebrale al fine di valutare come le popolazioni cellulari cerebrali rispondano all’invasione leucemica. I risultati ottenuti evidenziano come, nel tessuto cerebrale in cui sono state iniettate cellule leucemiche pre-trattate con Attivina, ci sia una maggiore espressione di geni che favoriscono lo sviluppo di un microambiente anti-infiammatorio/pro-leucemico e uno spegnimento dei geni coinvolti nella risposta pro-infiammatoria/anti-leucemica. Questo risultato suggerisce che Attivina di tipo A potrebbe svolgere un ruolo chiave nella promozione di un microambiente cerebrale che supporta la crescita delle cellule leucemiche.
Inoltre, sono state usate tecniche di microscopia a fluorescenza per meglio definire le interazioni tra cellule leucemiche e cellule del sistema nervoso al fine di comprendere meglio quali molecole siano coinvolte nella promozione di un microambiente cerebrale più favorevole alla crescita delle cellule leucemiche. I risultati preliminari hanno mostrato che le cellule leucemiche interagiscono strettamente con le cellule del sistema nervoso, in particolare con la popolazione microgliale. Tutti questi risultati mostrano come il sistema in vitro delle fettine organotipiche corticali cerebrali murine messo a punto dalla Dott.ssa Di Marzo, rappresenti un valido strumento per comprendere cosa accade, a livello cellulare e molecolare, quando la leucemia invade il CNS. Inoltre grazie a questo sistema verranno condotti ulteriori studi per caratterizzare in modo più fine l’effetto delle cellule leucemiche pre-trattate e non con Attivina di tipo A sul microambiente cerebrale mediante l’utilizzo del microscopio a fluorescenza, del microscopio confocale e mediante il “time lapse microscopy” che permetterà di analizzare in tempo reale la diffusione della cellula leucemica nel tessuto cerebrale e le sue interazioni con la microglia. Inoltre, verranno ricercate le molecole responsabili dell'aumento della metastatizzazione al CNS, mediante sistemi multiparametrici di determinazioni di proteine. Tutti questi studi aiuteranno a comprendere meglio come la cellula leucemica, stimolata o no con Attivina di tipo A, sia in grado di invadere il CNS, di insediarsi modificando il microambiente a suo favore e di proteggersi così dai farmaci chemioterapici, permettendo così l’identificazione di nuovi target terapeutici e trattamenti sempre più efficaci.

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